Un kit de ensamblaje de ADN para desbloquear CRISPR

Característica del 30 de agosto de 2023

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por Thamarasee Jeewandara, Phys.org

Las repeticiones de palíndromo cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR) y la proteína 9 asociada a Crispr (CRISPR/Cas9) son ahora un método revolucionario y bien conocido para diseñar células microbianas.

Una ventaja clave de CRISPR sigue siendo el diseño de la cepa para facilitar la integración cromosómica y permitir el ensamblaje de ADN libre de marcadores. Estos sistemas de edición son muy beneficiosos; sin embargo, su montaje no es del todo sencillo y puede impedir su uso y aplicaciones.

En un nuevo informe en Nature Communications Biology, Tigran V. Yuzbashev y un equipo de investigación identificaron los límites de los kits de herramientas Cas9 existentes diseñados para facilitar el acceso y la implementación de las técnicas CRISPR. Discutieron tres métodos diferentes bien establecidos y los combinaron para formar un conjunto de herramientas completo para la ingeniería metabólica eficiente mediante el uso de CRISPR/Cas9.

Un único conjunto de herramientas compuesto por 147 plásmidos para generar y caracterizar una biblioteca de 137 promotores para construir un ácido homogentísico en el laboratorio.

El sistema CRISPR/Cas9 puede generar modificaciones genómicas rápidas, precisas y sin cicatrices para brindar un margen significativo para diseñar cepas microbianas para la bioproducción. La ingeniería metabólica de levaduras, por ejemplo, constituye un área de rápido crecimiento en ingeniería biológica para la producción sostenida de productos químicos, combustibles, alimentos y productos farmacéuticos.

Las levaduras tienen un potencial metabólico similar al de las células eucariotas y, por lo tanto, son más fáciles de diseñar y cultivar a escala. Como resultado, los bioingenieros han diseñado y desarrollado sistemas CRISPR para levaduras.

Debido a su alta eficiencia, CRISPR permite modificaciones genómicas sin marcadores. En este trabajo, Yuzbashev garantizó la optimización de las cepas y facilitó proyectos de ingeniería metabólica identificando tres mejoras del sistema CRISPR/Cas9 para la ingeniería de levaduras. Los métodos incluyeron: 1) el intercambio fácil entre modificaciones con marcador y sin marcador, 2) el intercambio rápido de brazos de homología para determinar diferentes ubicaciones de integración y 3) un método fácil para clonar ARNg.

Para permitir la integración libre de marcadores basada en CRISPR, el equipo eligió una rotura de doble cadena inducida por Cas9, que tuvo que ser reparada para lograr la proliferación celular. Los científicos hicieron esto posible mediante el uso de una plantilla o donante, integrado mediante recombinación homóloga o unión de extremos no homóloga (NHEJ), sin integración. El proceso de unión de extremos no homólogos se observa en la mayoría de las especies de hongos, incluida la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae.

En especies con un mecanismo NHEJ predominante, el equipo mejoró la recombinación homóloga eliminando los genes NHEJ. Si un método sin marcadores no tuvo éxito, los científicos intentarán mejorar la integración asistida por CRISPR-Cas9 para volver fácilmente a la integración basada en marcadores.

La integración asistida por Cas9 normalmente requiere una plantilla de donante que consta de un casete integrado flanqueado por dos brazos de homología. El equipo teorizó que la integración ideal de CRISPR/Cas9 debería intercambiar brazos de homología en construcciones donantes de Cas9 evaluadas previamente mediante una reacción de ensamblaje Golden Gate simplificada.

Además, los promotores son un elemento clave en cualquier proyecto de ingeniería metabólica para redirigir el flujo hacia los productos de interés. Yuzbashev et al. utilizó la levadura industrial Yarrowia lipolytica para desarrollar un conjunto de herramientas de ingeniería metabólica que combinaba estrategias de edición de genes y ensamblaje de ADN para lograr una alta eficiencia y versatilidad.

Los científicos liberaron todo el potencial de CRISPR/Cas9 para la ingeniería metabólica mediante el desarrollo de un conjunto de herramientas que amplía los sistemas de ensamblaje Golden Gate previamente conocidos. Probaron el sistema de detección generando varias bibliotecas de promotores. Yuzbashev et al. Eligieron genes ribosómicos de Y. lipolytica que codifican proteínas de subunidades grandes y pequeñas. Identificaron una variedad de promotores con diversas fortalezas para ampliar la cantidad de promotores para el mismo organismo.

Para demostrar la influencia y el uso del método CRISPR/Cas9 mejorado, el equipo creó una Y. lipolytica mediante ingeniería racional para producir un ácido homogentísico (HGA). Normalmente, en condiciones alcalinas, el HGA se oxida espontáneamente para formar piomelanina autopolimerizada; un excelente componente de protectores solares y cosméticos naturales.

A pesar de su alto potencial comercial, los métodos existentes para producir el precursor ácido y el producto de piomelanina se basaban en la biotransformación de costosos aminoácidos aromáticos. Para facilitar la ingeniería metabólica, el equipo seleccionó primero varios genes que codificaban las aminotransferasas aromáticas precursoras como objetivos de ingeniería. Luego seleccionaron tres objetivos de sobreexpresión para mejorar la síntesis de novo del ácido homogentísico en el organismo modelo. Finalmente, estudiaron e inactivaron la vía de degradación del HGA; un camino aún desconocido que existe en Y. lipolytica.

De esta manera, Tigran V. Yuzbashev y sus colegas demostraron la dependencia de la ingeniería metabólica de los organismos vivos de métodos eficaces de manipulación del ADN. Este trabajo presenta un ejemplo de un conjunto de herramientas moleculares mejorado diseñado para la ingeniería metabólica basada en CRISPR/Cas9.

Los científicos demostraron la funcionalidad de la plataforma tanto para la construcción rápida de cepas como para la caracterización de una gran biblioteca de promotores. Anticipan que este conjunto de herramientas tendrá aplicaciones más amplias en la ingeniería de tensiones y en la industria. El equipo prevé que el modelo de Y. lipolytica desarrollado en este trabajo también tenga aplicaciones generales en otros campos de la ingeniería biológica.

Más información: Tigran V. Yuzbashev et al, Un conjunto de herramientas de ensamblaje de ADN para desbloquear el potencial de CRISPR/Cas9 para la ingeniería metabólica, Communications Biology (2023). DOI: 10.1038/s42003-023-05202-5

Guri Giaever et al, Perfil funcional del genoma de Saccharomyces cerevisiae, Nature (2002). DOI: 10.1038/naturaleza00935

Información de la revista:Naturaleza, Biología de las Comunicaciones

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